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在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)至少存在10種TLRs分子,為何機體內(nèi)存在多種TLRs?現(xiàn)已研究證實,這是由于宿主識別不同微生物的需要而形成的免疫機制,如在果蠅,Toll家族不同成員參與對不同病原菌的防御作用:Toll 主要介導(dǎo)抗真菌反應(yīng),18-Wheeler拮抗細菌感染。哺乳動物TLRs家族不同成員對微生物及其PAMPs的識別作用也存在相對的特異性。表7-3顯示TLR家族成員不僅識別脂質(zhì)和多糖(如LPS、肽聚糖),而且也與細菌或病毒DNA、RNA和蛋白質(zhì)作用。
TLR4是研究最早、作用也最為明確的TLR分子。除細菌LPS外,近年來也發(fā)現(xiàn)了其他一些配體,如抗腫瘤藥物泰素﹑熱休克蛋白60(hsp60)等。識別的病原菌主要有革蘭陰性菌、厭氧菌、致密螺旋體。有人認為,TLR4還能識別病毒融合蛋白(respiratory scyncytial virus,RSV),但該研究采用的動物是C57BL/10ScCr小鼠,這種小鼠體內(nèi)同時缺失Tlr4和IL-12受體β2鏈基因。由于1L-12是天然免疫和適應(yīng)性免疫拮抗病毒感染的關(guān)鍵細胞因子,以及C57BL/10ScCr小鼠對IL-12,無反應(yīng)。因此,TLR4對RSV的識別作用尚待探討。
TLR4雖能識別多種配體,但主要配體是細菌LPS,同CD14分子一樣,作為一種重要的LPS興奮性受體,在介導(dǎo)革蘭陰性細菌及其LPS的宿主反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果顯示,將TLR4基因轉(zhuǎn)入不表達TLR4的細胞內(nèi),可使不具有LPS反應(yīng)的細胞具有一定的LPS反應(yīng)性。相反,將LPS反應(yīng)細胞內(nèi)的TLR4基因進行突變或缺失,細胞則出現(xiàn)LPS低反應(yīng)性或耐受??筎LR4抗體能抑制不同血清型腸道桿菌LPS刺激人THP-1細胞釋放TNFα的作用,但對肽聚糖、熱滅活金黃色葡萄球菌等無抑制作用。
此外,TLR4胞外區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的點突變也顯示與人呼吸道LPS低反應(yīng)性有一定的內(nèi)在聯(lián)系。骨髓移植病人自身或供者tlr4基因胞外區(qū)缺陷人群中,骨髓干細胞移植后革蘭陰性膿毒癥的發(fā)生率為16.7%,而正常TLR4的受者中,其感染的發(fā)生率為6.6%,提示TLR4 胞外區(qū)的突變可增加內(nèi)毒素血癥的危險性。
然而,最能說明TLR4作為LPS重要受體的是近年來關(guān)于Lps基因的研究。1978年,James Watson首-次提出小鼠體內(nèi)可能存在控制LPS反應(yīng)的特定基因,取名為Lps,認為該基因可能有兩個等位基因:即Lpsd(defective response>和Lpsn (normal response)。三種天然LPS低反應(yīng)小鼠品系C3H /HeJ、C57BL/10ScCr和C57BL/10ScN的Lps等位基因為Lpsd,表現(xiàn)為對LPS刺激的耐受性。James Watson等通過基因作圖將Lps基因座定位于小鼠4號染色體上。20世紀90年代以來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,先后有多個研究小組采用定位克隆策略,對Lps基因座重新進行精細作圖,繪制出圍繞Lps基因座染色體區(qū)的高分辨連鎖圖,最終將Lps基因座定位于0.9 cM、1.7~2.6Mb長的片段內(nèi)。
為了進一步明確Lps基因座內(nèi)的候選基因及其編碼蛋白,1998年P(guān)oltorak等對該重要區(qū)域進行高密度測序(近4萬次),以及利用外顯子捕獲﹑選擇性原位雜交和定位克隆等技術(shù),在其區(qū)域內(nèi)鑒別出多個基因,如TLR4基因、鋅脂蛋白基因、Tera同構(gòu)體基因、大部分Pappa基因序列(編碼一種分泌型金屬蛋白酶)、芳香乙酰胺脫乙?;富蚝蚢strotactin同構(gòu)體基因,Tlr4是唯-一與LPS作用有關(guān)的基因,Tlr4全長基因都位于Lps基因座內(nèi)。其他學(xué)者也獲得同樣結(jié)果。
進一步研究顯示,C3H/HeJ小鼠Tlr4cDNA的第2342位,即第3個外顯子上出現(xiàn)一個堿基顛換:C→A。在LPS反應(yīng)品系小鼠基因組DNA中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的堿基突變。此外,C3H/HeJ、C3H/HeN、C57BL/10ScSn小鼠巨噬細胞均能檢測出Tlr4 mRNA,但不能檢測出C57BL/10ScCr小鼠巨噬細胞的Tlr4 mRNA。上述結(jié)果說明,C3H/HeJ小鼠Tlr4為點突變,其突變并不影響Tlr4的轉(zhuǎn)錄,C57BL/10ScCr小鼠Tlr4基因則為完-全缺失,即為無效等位基因(null allele),有74723個核苷酸缺失,這包括了該基因的所有三個外顯子,因而出現(xiàn)隱性突變。由于Tlr4位于Lps內(nèi),兩種 LPS耐受株小鼠的Tlr4基因均發(fā)生錯義突變(missense mutation)或缺失,進一步證實Tlr4基因就是Lps的最佳候選基因。
進一步研究顯示,T1r4基因的突變具有重要的功能意義。C3H/HeJ小鼠Tlr4基因第3個外顯子上的點突變雖不影響該基因的轉(zhuǎn)錄,但因其密碼子的變化,使蛋白氨基酸序列上第712位高度保守的脯氨酸(proline)變?yōu)榻M胺酸(histidine)。該區(qū)域正為蛋白質(zhì)的胞漿區(qū),該胞漿區(qū)為進化中最保守的結(jié)構(gòu)域,其結(jié)構(gòu)域的完整性對于通過TLRs介導(dǎo)的LPS信號至關(guān)重要。這種氨基酸殘基的替換改變了TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)區(qū)域的拓撲結(jié)構(gòu),進而破壞了與下游分子蛋白一蛋白間的相互作用,從而表現(xiàn)出對LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共顯性抑制作用。C57BL/10ScCr小鼠因Tlr4基因完-全缺失,不能表達TLR4蛋白,因而出現(xiàn)對LPS反應(yīng)的隱性消失(recessive abolition)。由此可見,C3H/HeJ和C57BL/10ScCr的突變表型分別與Tr4點突變或基因缺失非常吻合。