一、苯酚╱氯仿╱石油醚法(PCP)
LPS分子鑲嵌于胞壁的外膜中,用某些化學(xué)試劑將胞壁裂解(如酚)后,LPS分子從破潰的胞壁中游離出來。由于LPS是一種兩性分子,故它們?cè)诓煌軇┲械娜芙舛龋?取決于該分子上的親水/疏水性基團(tuán)的多少。S-LPS有完整的親水性О特異性側(cè)鏈,所以S型LPS屬親水性分子。而R型LPS,缺乏O特異性側(cè)鏈,含有完整或不完整的核心多糖和完整的類脂A,親水度不大,而易溶于有機(jī)溶劑中,故而R-LPS用酚水法提取時(shí)所得的產(chǎn)量極低。
PCP法是以90%苯酚、氯仿及石油醚(40~60℃)以2:5:8所組成的單相混合提取液,這一提取方法只能將LPS及與之緊密結(jié)合的透道蛋白(Porin)提取出來,而其它成分則排除在提取液外。PCP法的水沉淀步驟僅能使LPS發(fā)生沉淀,而透道蛋白仍溶于苯酚中,故而PCP法所提取的LPS是一種較為純化的制劑。
PCP法對(duì)制取R型細(xì)胞的LPS產(chǎn)量十分滿意,且無核酸污染,蛋白質(zhì)含量也僅在0.1~1 %間,該法溫和,在室溫5~20℃即可完成,制取周期較短,適用于從Ra至Re的細(xì)菌,可成功地提取R-LPS,產(chǎn)量也相當(dāng)高。故PCP法是研究R-LPS的有用方法。應(yīng)必須注意的是在PCP法中,每一步操作均不應(yīng)使用鹽類,如MgCl2、CaCl2,否則會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)量。
二、高壓超聲處理法
以某些物理方法(如超聲波)處理菌體細(xì)胞,使其*破裂,可增加繼后提取方法的*性,從而可使LPS的產(chǎn)率增加。Richard1983研制了一種既可提取光滑型又可提取粗糙型LPS的新方法。該方法采用了高壓處理(15000Ib/in2)細(xì)菌的方法,粉碎菌細(xì)胞,繼又用超聲波處理,促進(jìn)碎片*裂解,再以DNa s e,RNa s e處理,消化核酸。再加入蛋白酶去消化蛋白質(zhì),離心12000xg,濃縮干燥。如此制得的LPS,產(chǎn)量為菌體的51~81%(按測脂肪酸、庚糖和KDO值),蛋白質(zhì)為0.1%、核酸1 %、脂類2~5%,純度較高,產(chǎn)量比酚水法高7倍,比PCP法高2倍。
所得LPS經(jīng)各種免疫化學(xué)分析,均提示用此方法提取的LPS其抗原結(jié)構(gòu)完整。其不足之處是堿性條件上的加熱,以前認(rèn)為這一處理在于除掉蛋白質(zhì),特別是對(duì)于有些細(xì)菌(如綠膿桿菌)有用,但對(duì)別的細(xì)菌恐屬多余。應(yīng)當(dāng)指出的一點(diǎn)是,堿性加熱條件使類脂體A上的脂肪酸酯降解。另外一個(gè)不足之處是,此方法較為復(fù)雜,不易被一般實(shí)驗(yàn)室采用。
三、DMSO法
Adams介紹了一種較為簡單的LPS提取方法。該法應(yīng)用二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)作為主要提取試劑。以胞壁原料提制LPS。主要步驟為將預(yù)先制取的干燥胞壁以60℃DMSO提取水洗,酸化丙酮處理,冷凍干燥。DMSO法提取的LPS產(chǎn)量是酚水法的10倍,但蛋白質(zhì)含量很高(45%) 。